Антистрессорньй эффект внутривенно введенного L-Аргинина при повреждении печени крыс, вызваннном ишемией-реперфузией

Ишемия-реперфузия печени - широко распространенный синдром, с которым часто сталкиваются при различных клинических ситуациях, включая травмы, геморрагический шок, резекцию печени и ее трансплантацию.

В процесс ишемии-реперфузии вовлечены ферментативная система цитохрома Р450, супероксид-дисмутаза, каталаза, супрол, в связи с чем изучение возможного влияния L-аргинина на эти ферменты представляет научный интерес. При ишемии- реперфузии (и/р) активные формы кислорода (АФК), продукты перекисного окисления липидов и нитроксильный радикал (NO) в высоких концентрациях оказывают повреждающие эффекты на гепатоциты и в целом на печеночную ткань [1,2]. В подавляющем большинстве случаев продолжительность и/р (30-160мин) влияет на диапазон, а не на направление изменений уровня ключевых антиоксидантных ферментов гепатоцитов (Си,2п-СОД, Мп-СОД, каталаза, глутатионпероксидаза и т.д.), активность которых в основном снижается [5-8]. Путем снижения уровня АФК препараты антиоксидантной активности (карнозин [6], куркумин [9], лефлуномид [10], витамины Е и С) оказывают антиапоптотический, антинекрозный и антистрессорный эффект [11,8].

Имеются данные, свидетельствующие о том, что протективный эффект при и/р печени крыс оказывает и L-аргинин, являющийся предшественником NO. Внутривенно введенный L-аргинин снижает степень воспалительных процессов в тканях крыс [12], вызывает положительные гистохимические изменения печени со снижением степени инфильтрации нейтрофилов in vivo и ex vivo [3,4], повышает выживаемость животных при и/р печени. Экзогенно введенный L-аргинин в большей степени, чем витамины Е и С оказывает положительное воздействие при и/р печени крыс путем снижения уровня продуктов перекисного окисления липидов и предотвращения инактивирования каталазы [8].

Выраженное антиоксидантное действие L-аргинина проявляется in vitro и ex vivo резким повышением под его влиянием активности каталазы, СОД, снижением НАДРН-зависимой О_2¯ – продуцируемой и повышением метгемоглобин (метНЬ)-восстанавливающей активности новых изоформ цит b558 из мембран красных кровяных клеток, клеток печени и селезенки. С другой стороны, молекулярно-биохимические механизмы воздействия экзогенного L-аргинина на содержание и активность ключевых антиоксидантных металлопротеинов (СОД, каталаза, церулоплазмин и трансферрин) и металлопротеинов прооксидантной активности (новые типы изоформ цит b₅₅₈ и супероксид- продуцирующий липопротеин сыворотки высокой плотности - супрол [14]) при и/р печени крыс in vivo еще не определены.

Целью работы является определение количественных и качественных изменений этих металло протеинов, регуляторов метаболизма АФК крови, селезенки и печени после и/р печени под влиянием экзогенно введенного L-аргинина.

Материал и методы

Опыты проведены на белых половозрелых крысах мужского пола массой 180-220г, которые подвергались воздействию тотальной ишемии-реперфузии печени. Последние 24ч перед опытом крысы получали только воду. Ишемия вызывалась следующим образом: после наркоза хлоралгидратом (1мл 4% раствора хлоралгидрата на 100г массы животного) производился разрез по белой линии живота, потом атравматичной клипсой перекрывались воротная вена, печеночная артерия и желчевыводящий проток. Через 40мин поток крови возобновлялся путем снятия клипсы с перекрытых сосудов. Во время реперфузии абдоминальная полость прооперированной крысы была покрыта пластиковым материалом во избежание дегидратации. Реперфузия длилась 3,5ч, после чего крысы подвергались декапитации. Кровь стабилизировали в 0,2% цитрата натрия. Одновременно отделяли селезенку и печень животных.

Белые беспородные крысы были разделены на 4группы (по 16 животных): животные контрольной группы получали внутривенно 0,5мл физиологического раствора; животные первой опытной группы (ОГ-1) подвергались и/р печени в приведенном режиме; животные второй группы (ОГ-2) за 10мин до начала ишемии получали внутривенно (путем медленной инфузии в бедренную вену) 100мг/кг L-аргинина фирмы “Ликвор”, растворенного в 1мл физраствора; животные третьей опытной группы (ОГ-3) за 10мин до начала ишемии получали 400мг/кг L-аргинина аналогичным образом.

Металлопротеины антиоксидантной активности - МАА (Сu,Zn-СОД и каталаза - из цитоплазмы эритроцитов, церулоплазмин и трансферрин – из сыворотки крови, суммарная фракция Сu,Zn-СОД и Мп-СОД из цитоплазмы клеток селезенки и печени) и металлопротеины прооксидантной активности - МПА (цит b₅ из цитоплазмы эритроцитов, изоформы цит b₅₅₈ эритроцитарных мембран, мембран клеток селезенки и печени, цит С из митохондрий селезенки и печени, супрол - из сыворотки крови) одновременно получали биотехнологическим методом [22], без использования детергента [23], который снижает стабильность мембранных цит b_558.

Количество МП определяли оптическим спектральным методом путем измерения плотности ха-рактерного максимального оптического поглощения для цит b₅ при 525нм, изоформ цит b₅₅₈ - 5 3 0, супро- ла - 430, церулоплазмина - 610 и трансферрина - 470нм. Супероксиддисмутазную (СОД) активность и О₂^- -продуцирующую активность супрола и изоформ цит b₅₅₈ ЭМ, МКС и МКП в гомогенной и гетерогенной фазах определяли нитротетразолиевым синим (НТС) путем вычисления процента ингибирования (в случае СОД) или стимулирования образования формазана (при 560нм) в результате восстановления НТС супероксидными радикалами. За единицу СОД- активности или О₂^--продуцирующей активности принимали количество белка, которое соответственно подавляет или стимулирует образование формазана на 50%.

Каталазную активность фракций определяли перманганатометрическим титрованием раствора перекиси водорода в присутствии и отсутствии каталазы. За единицу каталазной активности принимали то количество фракции (белка), которое расщепляет 0,1М перекиси водорода в течение 1мин при 20^оС.

Оптические спектральные измерения осуществляли на спектрофотометреоС.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли общеизвестным методом вариационной статистики Стьюдента-Фишера, с определением критерия достоверности р.

Результаты и обсуждение

И/р печени в приведенных условиях вызывает заметное снижение уровня и активности МАА в ОГ-1 не только в крови, но и в цитоплазме клеток селезенки и печени (таблица,А). В ОГ-2 и, особенно, в ОГ-3 наблюдается существенное повышение уровня и активности МАА, кроме трансферрина, содержание которого продолжает понижаться даже под влиянием 400мг/кг L-аргинина. Наблюдаемые изменения в ОГ-1 (и/р печени в отсутствии L-аргинина), скорее всего, связаны с резким повышением уровня перекиси водорода в красных кровяных клетках, клетках селезенки и печени, как результат снижения в них каталазной активности. Перекись водорода, особенно, продукт ее расщепления-гидроксильный радикал (НО), необратимо инактивирует, денатурирует церулоплазмин, Сu,Zn-СОД (но не Мn-СОД) и даже каталазу [15-18]. Из-за этого суммарная активность Сu,Zn-СОД и Мп-СОД в цитоплазме клеток селезенки и печени снижена меньше, чем в цитоплазме эритроцитов (в эритроцитах локализована только Сu,Zn-СОД). Гипоксия при и/р также приводит к увеличению эндогенного уровня перекиси водорода в клеточных образованиях тканей, с соответственным снижением активности ключевых МАА. Экзогенно введенный L- аргинин вызывает непрямолинейное дозозависимое увеличение содержания и активности почти всех МАА.

Уровни МПА (изоформы цит b₅₅₈ и супрола) также снижены в ОГ-1, хотя содержание цит b₅ и цит С повышаются (таблица,Б). Повышение содержания цит b₅ из цитоплазмы красных кровяных клеток связывается с иммобилизацией животных, на начальных стадиях которой наблюдается существенное повышение уровня этого гемопротеина [19]. Повышение уровня цит С может быть связано с увеличением степени рилизинга этого белка из митохондрий (это явление характерно для многих патологических состояний, ассоциированных с определенным фоном оксидативного стресса). Снижение уровня супрола связывается с увеличением продуцируемых самим супролом О_{2¯ –} (соответственно и Н₂О₂, как продукта ферментативного дисмутирования О2¯ [16]). Последние совместно с гидроксильными радикалами инициируют процесс перекисного окисления фосфолипидных остатков этого липопротеина сыворотки, вызывая его дестабилизацию (агрегацию).

Механизм снижения содержания изоформ цит b₅₅₈ из ЭМ, МКС и МКП в ОГ-1 (таблица, Б) также связывается с воздействием перекиси водорода, которая вызывает необратимое денатурирование этих гемопротеинов [20]. Снижение содержания супрола может изменить микровязкость сыворотки и в целом микроциркуляцию крови, что и наблюдается при и/р [13]. Положительный эффект экзогенного L-аргинина в данном слечае выражается определенным повыше-нием содержания МПА, связанный частично с повы-шением активности каталазы.

В ОГ-1 (таблица, В) при и/р существенно повышается НАДРН-зависимая О₂^- -продуцирующая ак-тивность изоформ цит b₅₅₈ ЭМ, МКС и МКП, как ответ адаптационных систем организма для сохранения необходимого уровня О_2¯ –в условиях гипоксии при и/р, для обеспечения нормального течения аэробных метаболических процессов в этих экстремальных условиях, при которых регуляторные системы метаболизма АФК не всегда действуют нормальным образом. Под влиянием L-аргинина, когда происходит заметное повышение эндогенного уровня МПА, видимо, отпадает необходимость увеличения НАДРН- зависимой О₂^- -продуцирующей активности изоформ цит b₅₅₈, которые являются важными компонентами для комбинированной НАДРН-оксидазы, ответственной за продуцирование О₂^- иммунными клетками (макрофаги, лимфоциты, полиморфонуклеарные лейкоциты и т.д.) при фагоцитозе [21]. 

Таблица. Относительное изменение (%) содержания и активности МАА и МПА эритроцитов, селезенки

и печени крыс после 40мин ишемии и 3,5ч реперфузии печени в отсутствии (ОГ-1) и под влиянием внутривенно введенного L-аргинина - 100мг/кг (ОГ-2) и 400мг/кг (ОГ-3), по сравнению с 100% контрольными по

казателями. Р‹ 0,05, n = 6.

A.

Б.

В.

Можно заключить, что при 40мин ишемии и 3,5ч реперфузии печени крыс оксидативное повреждение компонентов крови, селезенки и печени обусловлено характерным дисбалансом между продуцируемыми АФК металлопротеинами (МПА) и утилизирующими АФК металлопротеинами (МАА), как результат существенного снижения каталазной активности, с соответственным увеличением эндогенного уровня перекиси водорода, соответственно и НО' - радикалов, которые и являются ключевыми денатурирующими агентами этих металлопротеинов. Путем повышения каталазной активности внутривенно введенный L-аргинин (100 и 400мг/кг) играет антистрессорную роль при и/р печени, существенно уменьшая диапазон дисбаланса между МАА и МПА, улучшая кислородный гомеостаз и повышая выживаемость животных. На основе полученных результатов L-аргинин может быть рекомендован для применения при и/р (при трансплантации органов) как эффективный и практически безопасный антистрессорный агент. 

Список литературы

1. Komatsu H., Koo A., Ghadishah E. et al Neutrophil accumulation in ischemic reperfused rat liver: evidence for a role for superoxide radicals. AmJ.Physiol., 1992, 262(4 ptl), G669-G676.
2. Yoshikawa T., Ovamada H., Ichikawa H. et al. Role of active oxygen species and lipid peroxidation on in liver injury induced by ischemia reperfusion. Nippon shokakibyo gakkai Zasshi, 1990, 87(2), 199-205.
3. Rivera-Chavez F.A., Toledo-Perevra L.H. et al. Exogenous and endogenous nitric oxide but not iNOS inhibition improves function and survival of ischemically injured livers. J. Invest. Surg., 2001, 14(5), 265-273.
4. Higa T., Shiraishi M. et al. Limitation of exogenous L-arginine in exerting a cytoprotective effect on hepatic ischemia/reperfusion injury. Surg.Today, 2000, 30(4), 352-359.
5. Gonzalez-Flecha B., Cutrin J.C., Boveris A. Time course and mechanism of oxidative stress and tissue damage in rat liver subjected to in vivo ischemia-reperfusion. J.Clin. Invest., 1993, 91(2), 456-464.
6. Fouad A.A., El-Rehany M.A., Maghragy H.K. The hepatoprotective effect of carnosine against ischemia/ reperfusion liver injury in rats. Eur.J.Pharmacol., 2007, 572(1), 61-68.
7. Gupta M., Dobashi K., Greene E.L. et al. Studies on hepatic injury and antioxidant enzyme activities in rat subcellular organells following in vivo ischemia and reperfusion. Mol.Cell Biochem., 1997, 176(1-2), 337-347.
8. Rhee J.E., Lung S.E., Shin S.D. et al. The effects of antioxidants and nitric oxide modulators on hepatic ischemic-reperfusion injury in rats. J.Korean Med.Sci.,2002,17(4), 502-506.
9. Shen S.G., Zhang Y., Xiang J.J., Xiong C.L. Protective effect of curcumin against liver warm ischemia/reperfusion injury in rat model associated with regulation of heat shock protein and antioxidant enzymes. Woeld J.Gastroenterol., 2007, 13(13), 1953-1961.
10. Karaman A., Fadillioglu E., Turkmen E. et al. Protective effect of leflunomide against ischemia/reperfusion injury of the rat liver. Pediatr.Surg., 2006, 22(5), 428-434.
11. Munoz-Casares F.C., Padillo F.J., Briceno J. et al. Melatonin reduces apoptosis and necrosis induced by ischemia/reperfusion injury of the pancreas. J.Pincal. Res., 2006, 40(3), 195-203.
12. Erme M.H., Erdogan H., Fadillioglu E. Effect of BG- 123 and nitric oxide inhibition on liver in rats after renal infusion/reperfusion injury. Gen.Physiol.Biophys., 2006, 25(2), 195-206.
13. Uhfmann D., Scommotau S., Witzigmann H., Spiegel H.U. Exogenous L-arginine protects liver microcirculation from ischemia/reperfusion injury. Eur.Surg.Res., 1998, 30(3), 175-184.
14. Симонян ЕМ., Aрyтюнян A.A., Симонян Г.М., Симо- нян МА., Галоян A.A. Эффект внутрибрюшинно вве-денного БПП на активность изоформ цитохрома b558 тканей белых крыс. Ветеринарная Патология, 2007. 1(20), 147-150.
15. 15.15. Simonyan M.A., Nalbandyan R.M. Interaction of hy-drogen peroxide with superoxide dismutase from erythrocytes. FEBS Letters, 1972, 28(1), 22-24.
16. Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dis- mutases. Annu. Rev.Biochem., 1995, 64, 97-112.
17. Мжельская Т.Н. Биологическая функция церулоплаз- мина и их дефицит при мутациях генов, регулирующих обмен меди и железа. Бюлл. Эксп.Биол.Мед., 2000. 130 (8),124-132.
18. Potapovich M.V, Eremin A.N., Metelitsa D.I. Kinet-ics of catalase inactivation, induced by ultrasonic cavitation. Prikl.Biokhim.Mikrobiol., 2003, 39(2), 160-166.
19. Aкопян В.П., Симонян МА., Манукян A.A., Симонян ЕМ., Aкопян A.A. Дисбаланс между уровнями метал- лопротеинов крови в ранние сроки иммобилизации у крыс. Бюлл.Эксп.Биол.Мед., 2001, 11, 527-529.
20. Симонян Г.М., Симонян ЕМ., Симонян МА. Высокая резистентность сывороточных цитохромов b₅₅₈ Iи b₅₅₈II против перекиси водорода, по сравнению с другими гемопротеинами. В кн: Aкгyальные вопросы военной медицины. ЕрГМУ им. М.Гераци, 1999, с.48- 51.
21. Vignais P.V The superoxide-generating NADPH oxi-dase: structural aspects and activation mechanism. Cell Mol. Life Sci., 2002, 59(9), 1428-1459.
22. .Симонян МА., Симонян Г.М. - Способ получения металлопротеинов крови. Лицензия изобрет. No 341 Aрмпатента. Ереван, 1997.
23. Симонян Г.М., Симонян МА., Симонян ЕМ. - Способ получения цитохромов b из мембран эритроцитов. Лицензия изобрет. No 908 Aрмпатанта. Ереван, 2001. 

Вопросы, ответы, комментарии